4 Antociani, piranoantociani in barva vina

Jelena Topić Božič

Center za krožno gospodarstvo, Rudolfovo – Znanstveno in tehnološko središče, Novo mesto, Slovenija
Fakulteta za industrijski inženiring Novo mesto, Novo mesto, Slovenija

jelena.topic.bozic@rudolfovo.eu

---

Uvod

Fenolne spojine so spojine, ki prispevajo k organoleptičnim lastnostim vina, zlasti barvi, trpkosti in grenkobi. Kemijsko imajo fenolne spojine vsaj en fenolni obroč z vsaj eno hidroksilno skupino (Waterhouse in sod., 2016). V enološko kemijski literaturi za to skupino sekundarnih metabolitov najdemo tudi izraze, kot so polifenoli, biofenoli.

Fenolne spojine v vinu lahko razdelimo v dve skupini: neflavonoidne in flavonoidne fenolne spojine (He in sod., 2012a). Flavonoidi so najpogostejše fenolne spojine v grozdju in vinih. Družina flavonoidov se nadalje deli na podskupine flavonov, flavanolov, flavanonov in antocianov. Neflavonoidne fenole pa delimo na fenolne alkohole, fenolne kisline, hidroksicimetne kisline in stilbene (Waterhouse in sod., 2016).

Po Macheixu (1990) antociani vključujejo antocianidine in glikozilirane derivate antocianidinov – antocianine. Antocianidini so v naravi le redko prisotni in nastajajo v vzorcih največkrat zaradi priprav bioloških vzorcev za analizo. Brez glikozilacije so namreč zelo nestabilni in kmalu razpadejo (Macheix, 1990).

Naravno prisotni antociani so torej glikozilirani derivati aglikonskih delov antocianidinov. Najbolj pogoste antocianidine med njimi poznamo pod imenom delfinidin, petunidin, cianidin, peonidin in malvidin. Med sabo se razlikujejo po barvi katero odraža stopnja hidroksilacije in metoksilacije obroča B – mesti R¹ in R² na fenolnem obroču (Slika 1). Nadaljnja raznolikost antocianov iz vina/grozdja je posledica acilacije glikozidno vezane glukoze s hidroksicimetnimi kislinami (kavna kislina, p-kumarna kislina) ali alifatskimi kislinami, kot je ocetna kislina (He in sod., 2010; Lorrain in sod., 2013; Panche in sod., 2016; Waterhouse in sod., 2016). Antociani so naravni pigmenti, odgovorni za rdečo, modro in vijolično barvo sadja, zelenjave, rož in zelišč. Njihovo ime izhaja iz grškega anthos, kar pomeni roža, in kyanos, kar pomeni modro (Welch in sod., 2008).

Rdeča barva vin in grozdja izvira iz antocianov, ki so značilni predvsem za rdeče sorte grozdja. Večinoma se nahajajo v jagodni kožici, razen pri nekaterih sortah grozdja z obarvanim mesom. V pridelavi rdečih vin se po drozganju in med maceracijo izločajo v mošt in vino. S časom maceracije se izplen antocianov povečuje, vendar je odvisen tudi od fenolne zrelosti grozdja. Grozdje sort Vitis vinifera L. vsebuje večinoma monomerne antociane, kot so -3-O-monoglikozidi delfinidina, cianidina, petunidina, peonidina in malvidina. Najbolj zastopan antocian v rdečem vinu sort Viris vinifera L. je malvidin-3-O-glukozid, ki ima na mestu R1 in R2 metoksi skupino (sledi -3-O-glukozid peonidina, ki imata eno prosto skupino -OH na B-obroču (Freitas in sod., 2017; He in sod., 2010; Lorrain in sod., 2013) (Tabela 1). Pri sortah, ki niso Vitis vinifera L., pa se glikozilacija zgodi na mestih 3 in 5 (Sabra in sod., 2021).

Celokupna koncentracija antocianov v vinih je sortno pogojena. Waterhouse (2002) je ocenil, da je koncentracija v mladih vinih največkrat okoli 500 mg/L, v staranih vinih pa 90 mg/L (Waterhouse, 2002). V nekaterih primerih lahko skupna koncentracija preseže 2000 mg/L. Med različnimi sortami se koncentracije antocianov lahko zelo razlikujejo (Nikfardjam in sod., 2006). Nikfardjam in sod. (2006) so izvedli raziskavo, v kateri so ugotovili, da je povprečna koncentracija monomernih antocianov 831 mg/L v vinu sorte cabernet franc, medtem ko je bila koncentracija v pinot noir vinu 447 mg/L. Povprečna koncentracija v portovcih je bila 1642 mg/L (Nikfardjam in sod., 2006). Koncentracije posameznih antocianov zelo variirajo, v večini vin pa je večinoma prisoten malvidin-3-O-glikozid kot glavni prosti antocian (Lorrain in sod., 2013). Osnovna struktura glikoziliranih antocianov je prikazana na Sliki 1. Sladkorji so vezani preko glikozidne vezi na mestu C-3, diglikozidi pa tudi na mestu C-5 antocianidina. V grozdju in vinu so glikozilirani z glukozo. Antocianini so razširjeni v rdečem in modrem sadju ter zelenjavi, njihova vsebnost v rastlinah pa je med vrstami zelo različna. Poleg glikozilacije z glukozo se pojavljajo še drugi sladkorji, med njimi galaktoza, ramnoza, arabinoza in ksiloza (Merecz-Sadowska in sod., 2023).

Med seboj se razlikujejo glede na to, kateri skupini sta vezani na obroč B (Tabela 1) na mestih R¹ in R² (Slika 1). Njihov izplen pri pridelavi vina je odvisen od sorte grozdja, zrelosti, sezonskih razmer, vinogradniških praks, lege vinogradov in samih tehnoloških parametrov pridelave vina. Koncentracija antocianov v vinu je namreč odvisna tudi od pogojev fermentacije, kot so temperatura med fermentacijo ter čas in temperatura maceracije. Prisotnost skupnih antocianov in posameznih antocianov pa se v vinih spreminja tudi med staranjem vina (Champ and Kundu-Champ, 2019; He in sod., 2012a; Minnaar in sod., 2018).

Tabela 1. Kemijske strukture najpogostejših antocianov v rdečem grozdju in vinu (R¹ in R² v povezavi s Sliko 1).

Antocianin	Struktura R1	Struktura R2
delfinidin-3-O-glikozid	OH	OH
cianidin-3-O-glikozid	OH	H
petunidin-3-O-glikozid	OH	OCH3
peonidin-3-O-glikozid	OCH3	H
malvidin-3-O-glikozid	OCH3	OCH3

Antociani se pri mletju in drozganju že izločajo v grozdni sok ter že takrat začnejo reagirati z drugimi spojinami vina, kot so drugi fenoli, pa tudi polimerne spojine, kot so polisaharidi, ki pomagajo zaščititi monomerne antociane pred razbarvanjem zaradi kislega pH-ja mošta, ki se ponavadi giblje v območju 3,1 – 3,6 (Boulton in sod., 1996; Moreno in Peinado, 2012).

To lahko opazimo s spremembo barve iz začetne modrovijolične barve v temno rdečo barvo, kar imenujemo kopigmentacija. Gre za pomemben pojav v pridelavi rdečih vin, saj vpliva na barvno stabilnost in intenzivnost vina v različnih življenjskih obdobjih. Kopigmentacija je kemijska interakcija med antocianini, naravnimi pigmenti v grozdnih jagodah in brezbarvnimi fenolnimi spojinami, kot so flavonoli ali hidroksicimetne kisline, ter drugimi spojinami vina. Kopigmentacija izboljša barvo vina, tako da poveča absorpcijo svetlobe (hiperkromni učinek) in premakne barvni odtenek v modrordeče tone (batohroni premik). Ta interakcija ohranja intenzivno barvo v zgodnjih fazah staranja vina, ko so antociani še v velikih koncentracijah (Boulton in sod., 1996; Moreno and Peinado, 2012). Kopigmentacija tako omogoča pridelovalcem rdečih vin izboljšanje vizualne kakovosti vina, povečuje njegovo stabilnost in podaljšuje trajnost barvne intenzitete, kar je ključno za tržno privlačnost vina.

Reakcije antocianov z drugimi spojinami se nadaljujejo tudi pri fermentaciji in maceraciji, ko začnejo reagirati z drugimi produkti fermentacije in grozdja ter fenolnimi spojinami. Poznavanje teh sprememb lahko pomaga vinarju izboljšati kakovost vina oz. spremembe v vinu glede na čas. Te spremembe so še posebej vidne v rahleje obarvanih rdečih ali rosé vinih, pri katerih barvne note prehajajo iz lepe rdeče ali rožnate barve (pri roséjih) v opečnate tone.

Tudi med zorjenjem in staranjem vina antociani nadalje reagirajo z drugimi spojinami v vinu, kar povzroči nastanek novih pigmentov. Imenujemo jih piranoantociani. Med njimi so najbolj poznani vitizini in vinilfenolni piranoantociani. Zaradi prisotnosti teh spojin se spreminja barva vina med staranjem (Alcalde-Eon in sod., 2006; He in sod., 2012b), saj je zanje značilna večja intenzivnost barve, poleg tega so stabilnejše v kemijskem okolju vina (če vino razumemo kot raztopino). Manj so dovzetne za spremembe v vrednosti pH in koncentraciji kisika, odpornejše pa so na razbarvanje z žveplovim dioksidom in temperaturo (Freitas in sod., 2017). Zato so te spojine zanimive tudi kot možna naravna barvila v drugih živilskih izdelkih.

Pri sintezi piranoantocianov so kvasovke s sproščanjem metabolitov, prekurzorjev za nastanek vinilfenolnih piranoantocianov, zelo pomembne (Božič in sod., 2020a); prikazano na Sliki 2. Kvasovke z visoko aktivnostjo encima hidroksicinamatna dekarboksilaza (HCDC) lahko dekarboksilirajo fenolne spojine hidroksicimetne kisline v reaktivne vinilfenole, ki se kondenzirajo z antocianini, tako da nastanejo piranoantociani. Hidroksicimetne kisline p-kumarna, kavna, ferulna, sinapinska kislina lahko tudi neposredno reagirajo z antocianini, a ta mehanizem poteka počasi med staranjem vina (Suárez-Lepe in Morata, 2012).

Kvasovke lahko pomembno pripomorejo tudi k izgubi barve vina. Sestava in poroznost celičnih sten fermentiranih kvasovk lahko povzroči znatno adsorpcijo hlapnih spojin oziroma adsorpcijo antocianinov na celične stene. Ta lastnost je še posebej pomembna pri sortah grozdja z manjšo vsebnostjo antocianov kot je modri pinot (Morata in sod., 2005).

Metode za določanje antocianov in piranoantocianov v vinu

Pri analizi fenolov in antocianov v vinu se uporabljata dva glavna pristopa. Prvi temelji na določanju skupne vrednosti monomernih antocianov z različnimi spektrofotometričnimi metodami. Drug pristop pa na uporabi separacijskih metod z različnimi sistemi za odkrivanje, kvantifikacijo in prepoznavanje antocianov in piranoantocianov v vinih in drugih matriksih.

Ključno pri analizi antocianov in piranoantocianov je ustrezna predpriprava vzorcev na analizo, ki mora imeti čim boljši izplen, čim bolje mora ponazarjati dejansko stanje v naravi, seveda pa mora biti tudi cenovno ustrezna glede na namen tovrstnih analiz vina.

Predpriprava vzorcev vključuje postopek čiščenja vzorcev in predkoncentracije zlasti pri določanju piranoantocianov, saj so ti prisotni v manjših koncentracijah v primerjavi z antociani in zaradi kompleksnosti vinskega matriksa, ki lahko prekrije spojine, v manjših koncentracijah. Najpogostejši metodi priprave vzorcev sta ekstrakcija tekoče-tekoče (LLE) in ekstrakcija na trdnem nosilcu (SPE). Poznamo več različnih pristopov, ki se razlikujejo v uporabi organskih topil in različnih sorbentov. Ekstrakcija na trdnem nosilcu omogoča večjo avtomatizacijo postopkov, hitrejšo obravnavo večjega števila vzorcev, in tudi enake pogoje ekstrakcij. Pri pripravi vzorcev vina se najpogosteje uporablja zgolj predhodna filtracija brez predhodne dodatne obdelave vzorcev (Aleixandre-Tudo in sod., 2017; Blanco-Vega in sod., 2014; He in sod., 2012a; Lorrain in sod., 2013).

Spektrofotometrične metode za določanje antocianov in piranoantocianov v vinu

Za določanje skupnih vrednosti monomernih antocianov se uporabljajo spektrofotometrične metode, naštete v nadaljevanju.

• Diferencialna metoda glede na pH

Metoda izhaja iz dejstva, da monomerni antociani reverzibilno spreminjajo strukturo in barvo v odvisnosti od pH-ja. Tako je razlika absorbance pigmentov pri 520 in 700 nm ter pri pH 1 in 4,5 proporcionalna koncentraciji antocianinov. Za preračunavanje v koncentracijo se uporablja molski ekstinkcijski koeficient antocianina (glavnega) v izbrani raztopini.

• Metoda s klorovodikovo kislino

Metoda se uporablja za oceno skupne vsebnosti antocianov. Vzorci vina se razredčijo v 1 M raztopini HCl. Čez čas (30 min) se izmeri absorbanco pri valovni dolžini 520 nm. Običajno se uporabijo 20- ali 50-kratne razredčitve. Koncentracije antocianov se izrazijo kot ekvivalenti malvidin-3-O-glikozida (mg/L).

• Metoda z uporabo razbarvanja z metabisulfitom (angl. Bisulfite bleaching method)

Metoda temelji na dveh kemijskih lastnostih antocianov: na odvisnosti od pH-ja in učinku razbarvanja. Metoda podaja kvantitativne informacije o skupni koncentraciji rdečih pigmentov. Pri tem upošteva lastnosti metabisulfita, ki ga ima na barvne pigmente. Antociane razbarva, medtem ko se polimerni pigmenti ne razbarvajo, ker so odpornejši na razpadanje v prisotnosti SO₂. Absorbanca vzorca, ki se tretira z bisulfitom, se primerja z absorbanco netretiranega vzorca pri 520 nm. Antociani so izraženi kot ekvivalenti malvidin-3-O-glikozida (mg/L). Metoda poda informacije o skupni vsebini monomernih antocianov ob odštetju polimerne frakcije (Aleixandre-Tudo in sod., 2017; Giusti and Wrolstad, 2001). Piranoantociana, kot sta vitizin A in vitizin B, se ob prisotnosti bisulfita ne razbarvata in sta izražena kot polimerna barva. Po tej metodi lahko rezultati pokažejo preveliko koncentracijo antocianov, ker na nekatere polimerne pigmente vpliva tudi učinek razbarvanja (bolj izraženo v mladih vinih). Pri staranju vin nastanejo kompleksnejši pigmenti, ki so manj občutljivi za SO₂ (Aleixandre-Tudo in sod., 2017).

Separacijske metode za določanje antocianov in piranoantocianov v vinu

Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC) je najpogosteje uporabljena analizna tehnika za ločevanje in separacijo ter prepoznavanje polifenolnih spojin grozdja in vina, med njimi tudi antocianov. Pri tem se uporabljajo različni detektorji: masni spektrometer (MS), detektor na niz diod (DAD), UV-VIS detektor. Najpogosteje se pri potrjevanju uporabijo podatki vseh detektorjev, zlasti če standardne spojine niso dostopne na trgu.

Trenutno ni enotne kromatografske tehnike, ki bi lahko ločila različne skupine fenolnih spojin z eno kromatografsko analizo. Zato moramo, če želimo celoten profil fenolnih spojin, optimizirati izbor stacionarne faze, mobilne faze, gradientno elucijo, temperaturo in hitrost pretoka mobilne faze. Običajno se ločevanje fenolnih skupin izvaja z reverznofazno kromatografijo, pri kateri se uporabita nepolarna stacionarna faza in polarna mobilna faza (López-Fernández in sod., 2020). Polifenolne spojine grozdja in vina se med seboj razlikujejo v polarnosti, tako da pri reverznofazni kromatografiji iz kolone najprej eluirajo najbolj polarne spojine in nazadnje najmanj polarne spojine. Vrstni red teh spojin je bil že večkrat omenjen in ga lahko najdemo v literaturi – lahko nam tudi pomaga pri prepoznavanju fenolnih spojin grozdja in vina (Kalogiouri in sod., 2022).

Kombinacija, ki se danes najpogosteje uporablja za določanje profila antocianov, je tekočinska kromatografija visoke ločljivosti z detektorji na niz diod (DAD detektor), masnim spektrometrom (MS) ali tandemsko masno spektrometrijo (MS/MS) (He in sod., 2012a; Lorrain in sod., 2013). Pri uporabi DAD detektorja prepoznavanje spojin temelji na merjenju UV-VIS spektra spojine, retencijskega časa ter na primerjavi z retencijskim časom in UV-VIS spektrom analitskega standarda. Glavna pomanjkljivost DAD detektorja je nezmožnost razlikovanja med spojinami, ki imajo podobne spektroskopske značilnosti, čeprav lahko na podlagi spektrov v UV in VIS območju antocianine ločimo od flavonolov, flavan-3-olov in fenolnih kislin. Težavno je tudi razlikovanje med spojinami, ki koeluirajo pod izbranimi kromatografskimi pogoji. Kvantifikacija antocianinov poteka z eksterno kalibracijo z antocianinom samim, če je standardna spojina tržno dostopna, drugače pa antocianine lahko izražamo kot ekvivalente glavnega antocianina grozdja in vina, to je malvidin-3-O-glukozid. Na sliki 3 sta prikazana kromatograma vina modri pinot na dan stekleničenja (A) in po treh mesecih staranja (B). Prikazana sta UV-VIS spektra malvidin-3-O-glikozida (spojina je označena s številko 1) in piranoantociana malvidin-3-O-glikozid-4-vinilkatehola (spojina, označena s številko 2). Za malvidin-3-O-glikozid-4-vinilkatehol so prikazani tudi MS, MS² in MS³ spektri, saj komercialni standardi niso na voljo za prepoznavanje. Pri UV-VIS spektru piranoantocianov je viden ožji absorpcijski vrh, prav tako valovna dolžina, pri čemer je maksimalna absorpcija premaknjena, saj je absorpcijski vrh pri malvidin-3-O-glikozid-4-vinilkateholu 509 nm, medtem ko je pri malvidin-3-O-glikozidu 526 nm (Božič in sod., 2020b).

Uporaba HPLC-DAD metod pri prepoznavanju piranoantocianov je zelo omejena, saj komercialni analizni standardi niso na voljo. Za poglobljenejšo analizo antocianov in piranoantocianov se uporablja HPLC skupaj z masno spektrometrijo (MS) ali tandemsko masno spektrometrijo (MS/MS), ki omogočata prepoznavanje in kvantifikacijo analitov v vzorcu ali potrditev molekulske strukture. MS temelji na ločevanju analitov glede na njihovo razmerje med maso in nabojem (m/z). Poleg metode HPLC se za separacijo antocianov in piranoantocianov uporablja tudi tekočinska kromatografija ultravisoke ločljivosti (UPLC). V primerjavi s HPLC-jem so analize krajše, manjša je tudi poraba topil (Blanco-Vega in sod., 2014; Dipalmo in sod., 2016; Lorrain in sod., 2013; Valls in sod., 2009).

Določanje barve vina

Spektrofotometrična analiza

Barvo vina določamo z merjenjem absorbance svetlobe pri določenih valovnih dolžinah, običajno v območju od 400 do 700 nm. Spektrofotometer pošlje svetlobo skozi vzorec filtriranega vina, absorbanco (koliko svetlobe vino absorbira) pa merimo pri različnih valovnih dolžinah. Če je pri rdečih vinih absorbanca vzorca prevelika (večja od 1 AU), je treba vzorec redčiti s pufrom, ki ima pH enak pH-ju vina, ali pa uporabimo kiveto s krajšo optično potjo (1 mm namesto 10 mm). Za rdeča vina se običajno uporabljajo tri ključne valovne dolžine (OIV, 2019):

420 nm: za rumenkaste odtenke,

520 nm: za rdečkaste odtenke,

620 nm: za modrikaste odtenke.

S seštevkom absorbanc vseh treh valovnih dolžin dobimo parameter intenzivnost, z razmerjem med absorbanco 420 nm in 520 nm pa parameter, ki ga imenujemo odtenek (hue). Metoda je enostavna, hitra in ponovljiva. Primerna je za rutinsko uporabo in omogoča primerjavo med različnimi vzorci vin. Vendar pa ne upošteva kompleksnosti zaznavanja barve, saj jo določa samo na podlagi absorbance pri določenih valovnih dolžinah. Prav tako ne zagotavlja podatkov o barvnem tonu in nasičenosti (OIV, 2019).

Metoda CIE Lab

CIE Lab je barvni prostor, ki temelji na človekovem zaznavanju barve. Vzpostavila ga je Mednarodna komisija za osvetlitev (CIE) leta 1976. Barva je opredeljena s tremi koordinatami:

L*: svetlost oziroma temnost (0 = črna, 100 = bela);

a*: zeleno-rdeča os (negativne vrednosti = zelena, pozitivne vrednosti = rdeča);

b*: modro-rumena os (negativne vrednosti = modra, pozitivne vrednosti = rumena) (CIE, 2007).

Barva vzorca vina se izmeri s spektrofotometrom ali kolorimetrom, ki podatke pretvori v vrednosti L*, a* in b*. Te vrednosti omogočajo tridimenzionalno predstavitev barve vina, kar omogoča natančno in objektivno primerjavo med različnimi vini (Hunter and Harold, 1987; Wrolstad, 2005).

Metoda CIE Lab ponuja popolno sliko barve, vključno s svetlostjo, nasičenostjo in odtenkom. Omogoča natančno kvantifikacijo barvnih razlik, kar je pomembno za kakovostno kontrolo in raziskave. Zahteva bolj sofisticirano opremo in je nekoliko bolj zapletena za izvedbo v primerjavi s klasično spektrofotometrijo. Poleg tega je dražja (Hunter and Harold, 1987; Wrolstad, 2005).

Primerjava metode CIE Lab in klasične spektrofotometrije

Natančnost in kompleksnost. CIE Lab je bistveno natančnejša in upošteva celotno spektralno zaznavanje barve, medtem ko klasična spektrofotometrija meri le intenziteto svetlobe pri določenih valovnih dolžinah.

Stroški in zahtevnost. Klasična metoda je cenejša in lažja za izvedbo, medtem ko je CIE Lab zapletenejša in dražja, vendar ponuja podrobnejše podatke.

Uporaba v praksi. Spektrofotometrija je še vedno široko uporabljena v rutinskih analizah zaradi enostavnosti in stroškovne učinkovitosti, medtem ko se CIE Lab uporablja v raziskavah in za visokokakovostno kontrolo, kjer je potrebna natančna analiza barve (Hunter in Harold, 1987; Wrolstad, 2005).

Viri

Alcalde-Eon, C., Escribano-Bailón, M. T., Santos-Buelga, C., Rivas-Gonzalo, J. C. 2006. Changes in the detailed pigment composition of red wine during maturity and ageing. Anal. Chim. Acta 563, 238–254. https://doi.org/10.1016/j.aca.2005.11.028

Aleixandre-Tudo, J. L., Buica, A., Nieuwoudt, H., Aleixandre, J. L., du Toit, W. 2017. Spectrophotometric Analysis of Phenolic Compounds in Grapes and Wines. J. Agric. Food Chem. 65, 4009–4026. https://doi.org/10.1021/acs.jafc.7b01724

Blanco-Vega, D., Gómez-Alonso, S., Hermosín-Gutiérrez, I. 2014. Identification, content and distribution of anthocyanins and low molecular weight anthocyanin-derived pigments in Spanish commercial red wines. Food Chem. 158, 449–458. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2014.02.154

Boulton, R. B., Singleton, V. L., Bisson, L. F., Kunkee, R. E. 2013. Principles and Practices of Winemaking. Springer Science & Business Media.

Božič, J. T., Butinar, L., Albreht, A., Vovk, I., Korte, D., Vodopivec, B. M. 2020a. The impact of Saccharomyces and non-Saccharomyces yeasts on wine colour: A laboratory study of vinylphenolic pyranoanthocyanin formation and anthocyanin cell wall adsorption. LWT 123, 109072. https://doi.org/10.1016/j.lwt.2020.109072

Božič, J. T., Ćurko, N., Ganić, K. K., Butinar, L., Albreht, A., Vovk, I., Korte, D., Vodopivec, B. M. 2020b. Synthesis of pyranoanthocyanins from Pinot Noir grape skin extract using fermentation with high pyranoanthocyanin producing yeasts and model wine storage as potential approaches in the production of stable natural food colorants. Eur. Food Res. Technol. 1–12. https://doi.org/10.1007/s00217-020-03467-2

Champ, C. E., Kundu-Champ, A. 2019. Maximizing Polyphenol Content to Uncork the Relationship Between Wine and Cancer. Front. Nutr. 6.

CIE. 2007. Colorimetry-part 4: CIE 1976 L* a* b* colour space. Int. Stand. 2019–06.

Dipalmo, T., Crupi, P., Pati, S., Clodoveo, M.L., Di Luccia, A., 2016. Studying the evolution of anthocyanin-derived pigments in a typical red wine of Southern Italy to assess its resistance to aging. LWT – Food Sci. Technol. 71, 1–9. https://doi.org/10.1016/j.lwt.2016.03.012

Freitas, V.A.P. de, Fernandes, A., Oliveira, J., Teixeira, N., Mateus, N. 2017. A review of the current knowledge of red wine colour. OENO One 51. https://doi.org/10.20870/oeno-one.2017.51.1.1604

Giusti, M. M., Wrolstad, R. E. 2001. Characterization and Measurement of Anthocyanins by UV-Visible Spectroscopy. Curr. Protoc. Food Anal. Chem. 00, F1.2.1-F1.2.13. https://doi.org/10.1002/0471142913.faf0102s00

He, F., Liang, N.-N., Mu, L., Pan, Q.-H., Wang, J., Reeves, M.J., Duan, C.-Q. 2012a. Anthocyanins and Their Variation in Red Wines I. Monomeric Anthocyanins and Their Color Expression. Molecules 17, 1571–1601. https://doi.org/10.3390/molecules17021571

He, F., Liang, N.-N., Mu, L., Pan, Q.-H., Wang, J., Reeves, M.J., Duan, C.-Q. 2012b. Anthocyanins and Their Variation in Red Wines II. Anthocyanin Derived Pigments and Their Color Evolution. Molecules 17, 1483–1519. https://doi.org/10.3390/molecules17021483

He, F., Mu, L., Yan, G.-L., Liang, N.-N., Pan, Q.-H., Wang, J., Reeves, M.J., Duan, C.-Q. 2010. Biosynthesis of Anthocyanins and Their Regulation in Colored Grapes. Molecules 15, 9057–9091. https://doi.org/10.3390/molecules15129057

Hunter, R. S., Harold, R. W. 1987. The Measurement of Appearance. John Wiley & Sons.

Kalogiouri, N. P., Karadimou, C., Avgidou, M. S., Petsa, E., Papadakis, E.-N., Theocharis, S., Mourtzinos, I., Menkissoglu-Spiroudi, U., Koundouras, S. 2022. An Optimized HPLC-DAD Methodology for the Determination of Anthocyanins in Grape Skins of Red Greek Winegrape Cultivars (Vitis vinifera L.). Molecules 27, 7107. https://doi.org/10.3390/molecules27207107

López-Fernández, O., Domínguez, R., Pateiro, M., Munekata, P. E. S., Rocchetti, G., Lorenzo, J. M. 2020. Determination of Polyphenols Using Liquid Chromatography–Tandem Mass Spectrometry Technique (LC–MS/MS): A Review. Antioxidants 9, 479. https://doi.org/10.3390/antiox9060479

Lorrain, B., Ky, I., Pechamat, L., Teissedre, P.-L. 2013. Evolution of Analysis of Polyhenols from Grapes, Wines, and Extracts. Molecules 18, 1076–1100. https://doi.org/10.3390/molecules18011076

Macheix, J.-J. 2017. Fruit Phenolics. CRC Press, Boca Raton. https://doi.org/10.1201/9781351072175

Merecz-Sadowska, A., Sitarek, P., Kowalczyk, T., Zajdel, K., Jęcek, M., Nowak, P., Zajdel, R. 2023. Food Anthocyanins: Malvidin and Its Glycosides as Promising Antioxidant and Anti-Inflammatory Agents with Potential Health Benefits. Nutrients 15, 3016. https://doi.org/10.3390/nu15133016

Minnaar, P., Nyobo, L., Jolly, N., Ntushelo, N., Meiring, S. 2018. Anthocyanins and polyphenols in Cabernet Franc wines produced with Saccharomyces cerevisiae and Torulaspora delbrueckii yeast strains: Spectrophotometric analysis and effect on selected sensory attributes. Food Chem. 268, 287–291. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2018.06.074

Morata, A., Gómez-Cordovés, M. C., Colomo, B., Suárez, J. A. 2005. Cell wall anthocyanin adsorption by different Saccharomyces strains during the fermentation of Vitis vinifera L. cv Graciano grapes. Eur. Food Res. Technol. 220, 341–346. https://doi.org/10.1007/s00217-004-1053-8

Moreno, J., Peinado, R. 2012. Enological Chemistry. Academic Press.

Nikfardjam, M. S. P., Márk, L., Avar, P., Figler, M., Ohmacht, R. 2006. Polyphenols, anthocyanins, and trans-resveratrol in red wines from the Hungarian Villány region. Food Chem. 98, 453–462. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2005.06.014

OIV. 2019. OIV – Compendium of International Methods of Analysis of Wines and Musts (2 vol.). International Organisation of Vine and Wine.

Panche, A. N., Diwan, A. D., Chandra, S. R. 2016. Flavonoids: an overview. J. Nutr. Sci. 5, e47. https://doi.org/10.1017/jns.2016.41

Sabra, A., Netticadan, T., Wijekoon, C. 2021. Grape bioactive molecules, and the potential health benefits in reducing the risk of heart diseases. Food Chem. X 12, 100149. https://doi.org/10.1016/j.fochx.2021.100149

Suárez-Lepe, J. A., Morata, A. 2012. New trends in yeast selection for winemaking. Trends Food Sci. Technol. 23, 39–50. https://doi.org/10.1016/j.tifs.2011.08.005

Topić, J., Korte, D., Mozetič Vodopivec, B. 2017. The comparison of anthocyanin and pyranoanthocyanin extraction efficiency in Pinot Noir wine using SPE. V: Book of abstracts 24^th young Investigators Seminar on Analytical Chemistry. Venice, Italy.

Topić Božič, J., Butinar, L., Antalick, G., Sternad Lemut, M., Martelanc, M., Albreht, A., Korte, D., Mozetič Vodopivec, B. 2022. The influence of selected indigenous yeasts on Pinot Noir wine colour properties. J. Sci. Food Agric. 102, 664–672. https://doi.org/10.1002/jsfa.11395

Topić Božič, J., Korte, D., Butinar, L., Mozetič Vodopivec, B., 2019. Yeasts and wine colour. Croat. J. Food Sci. Technol. 11, 291–302. https://doi.org/10.17508/CJFST.2019.11.2.17

Valls, J., Millán, S., Martí, M.P., Borràs, E., Arola, L. 2009. Advanced separation methods of food anthocyanins, isoflavones and flavanols. J. Chromatogr. A, Advanced Separation Methods in Food Analysis 1216, 7143–7172. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2009.07.030

Waterhouse, A. L. 2002. Wine Phenolics. Ann. N. Y. Acad. Sci. 957, 21–36. https://doi.org/10.1111/j.1749-6632.2002.tb02903.x

Waterhouse, A. L., Sacks, G. L., Jeffery, D. W. 2016. Understanding Wine Chemistry, Understanding Wine Chemistry. John Wiley & Sons, Ltd. https://doi.org/10.1002/9781118730720

Welch, C. R., Wu, Q., Simon, J. E. 2008. Recent Advances in Anthocyanin Analysis and Characterization. Curr. Anal. Chem. 4, 75–101.

Wrolstad, R. E. 2005. Current Protocols in Food Analytical Chemistry. John Wiley.