6 Poglavje 6: Antociani, piranoantociani in barva vina

Uvod

Fenolne spojine so spojine, ki prispevajo k organoleptičnim lastnostim vina, zlasti barvi, trpkosti in grenkobi. Kemijsko so fenolne spojine tiste spojine, ki vsebuejo vsaj en fenolni obroč, ki ima vsaj eno hidrokislno skupino (Waterhouse in sod., 2016). V literaturi, enološki kemiji za to skupino sekundarnih metabolitov najdemo tudi izraze kot so polifenoli, biofenoli.

Fenolne spojine v vinu lahko razdelimo v dve skupini; neflavonoidne in flavonoidne fenolne spojine (He in sod., 2012a). Flavonoidi so najpogostejše fenolne spojine v grozdju in vinih. Družina flavonoidov se nadalje deli na podskupine flavonov, flavanolov, flavanonov in antocianinov. Neflavonoidni fenole pa delimo na fenolne alkohole, fenolne kisline, hidroksicimetne kisline in stilbene (Waterhouse in sod., 2016).

Po Macheix (1990) antociani vključujejo antocianidine in glikozilirane derivate antocianidinov – antocianine. Antocianidini so v naravi le redko prisotni, in nastajajo v vzorcih največkrat zaradi priprav bioloških vzorcev za analizo. Brez glikozilacije so namreč zelo nestabilni in kaj kmalu razpadejo (Macheix in sod. , 1990).

Naravno prisotni antocianini so torej glikozilirani derivati aglikonskih delov antocianininov – antocianidinov, ki jih poznamo pod imenom delfinidin, petunidin, cianidin, peonidin in malvidin. Med sabo se razlikujejo v barvi, za katere je kriva stopnja hidroksilacije in metoksilacije obroča B – R1 in R2 pozicija na fenolnem obroču (Tabela 1). Nadaljnja raznolikost antocianinov iz vina/grozdja je posledica acilacije glukoze s hidroksicimetnimi kislinami (kavna kislina, p-kumarna kislina) ali alifatskimi kislinami, kot je ocetna kislina (Panche in sod., 2016; Waterhouse in sod., 2016; Lorrain in sod., 2013; He in sod., 2010). Antocianini so naravni pigmenti, odgovorni za rdečo, modro in vijolično barvo sadja, zelenjave, rož in zelišč. Njihovo ime izhaja iz grškega anthos, kar pomeni roža, in kyanos, kar pomeni modro (Welch in sod., 2008).

Rdeča barva vin in grozdja izvira iz antocininov, ki so pretežno značilni so za rdeče sorte grozdja. Večinoma se nahajajo v jagodni kožici, razen pri nekaterih sortah grozdja z obarvanim mesom. V pridelavi rdečih vin se po drozganju in med maceracijo izločajo v mošt in vino. S časom maceracije se izplen antocianinov povečuje, ki pa je odvisen tudi od fenolne zrelosti grozdja. Grozdje sort Vitis vinifera L. vsebuje večinoma monomerne antocianine, kot so -3-O-monoglikozidi delfinidina, cianidina, petunidina, peonidina in malvidina. Najbolj zastopan antocianinv rdečem vinu sort Viris vinifera L. je malvidin-3-O-glukozid, ki ima na R1 in R2 poziciji metoksi skupino (sledi -3-O-glukozid peonidina, ki imata eno prosto -OH skupino na B-obroču (Freitas in sod., 2017; He in sod., 2010; Lorrain in sod., 2013) (Tabela 1). Pri ne Vitis vinifera L. sortah pa se glikozilacija zgodi na mestih 3 in 5 antocianidina (Sabra in sod., 2021).

Celokupna koncentracija antocianov v vinih je je sortno pogojena, največkrat je okoli 500 mg/. Waterhouse (2002) je ocenil, da se koncentracija v mladih vinih giblje okoli 500 mg/L, v staranih vinih pa 90 mg/L (Waterhouse, 2002). V določenih primerih lahko skupna koncentracija preseže 2000 mg/L. Med različnimi sortami se koncentracije antocianov lahko zelo razlikujejo (Nikfardjam in sod., 2006). Nikfardjam in sod. (2006) so izvedli raziskavo, kjer so ugotovili, da je povprečna koncentracija monomernih antocianinov v vinu sorte Cabernet Franc 831 mg/L , medtem ko je bila koncentracija v vinu Pinot Noir  447 mg/L. Po drugi strani, pa je bila povprečna koncentracija antocianinov v različnih portovcih 1642 mg/L.

Koncentracije posameznih antocianinov zelo variirajo, v večini vin pa je v največji koncentraciji vin prisoten malvidin-3-O-glikozid, kot glavni prosti antocianin (Lorrain in sod., 2013). Osnovna struktura glikoziliranih antocianov je prikazana na sliki 1. Aglikoni antocianinov (antocianidini) so glikozidno vezani na sladkorje na položaju C-3 (Slika 1, levo), v primeru diglikzidov pa tudi na položaju C-5 antocianidina (Slika 2, desno). V grozdju in vinu so pretežno glikozilirani z glukozo. Antocianini so razširjeni v rdeče in modro obarvanem sadju ter zelenjavi, njihova vsebnost v rastlinah pa se močno razlikuje med različnimi vrstami. Poleg glikozilacije z glukozo, se pojavljajo tudi glikozilacije z drugimi sladkorji med njimi, galaktoza, ramnoza, arabinoza in ksiloza (Merecz-Sadowska in sod., 2023).

Slika 1: Osnovna struktura antocianov, ki spadajo v kategorijo monoglikozidov (levo) in diglikozidov (desnoj).

Med seboj se razlikujejo glede na to, katere funkcionalne skupine so vezane na B obroč (Tabela 1) na mestih R¹ in R² (Slika 1), ki pomembno vplivajo na barvo posameznih antocianinov.

Njihov izplen v procesu pridelave vina je odvisen od sorte grozdja, zrelosti, sezonskih razmer, vinogradniških praks, lege vinogradov in samih tehnoloških parametrov pridelave vina. Koncentracija antocianov v vinu je namreč odvisna tudi od pogojev fermentacije, kot so temperatura med fermentacijo in čas in temperatura maceracije. Prisotnost skupnih antocianov, posameznih antocianinov pa se v vinih spreminja tudi med staranjem vina (Champ and Kundu-Champ, 2019; Minnaar in sod., 2018; He in sod., 2012a).

Tabela 1: Kemijske strukture najpogostejših antocianinov v rdečem grozdju in vinu.

Antocianini se v procesu mletja in drozganja grozdja že izločajo v grozdni sok, in že takrat začnejo reagirati z drugimi spojinami grozdja in soka, kot so drugi fenoli, pa tudi polimerne spojine kot so polisaharidi, ki pomagajo zaščititi monomerne antocianine pred razbarvanjem zaradi pH mošta (Moreno and Peinado, 2012; Boulton in sod., 1996).

Slika 2: Nastanek vinilfenolnih piranoantocianov s pomočjo metabolitov kvasovk (Topić Božič in sod., 2019).

To lahko opazimo s spremembo barve iz začetne modro-vijolične barve drozge v temno rdečo barvo, zgodi se kopigmentacija. Kopigmentacija je pomemben pojav v pridelavi rdečih vin, saj vpliva na barvno stabilnost in intenzivnost vina v različnih življenskih obdobjih. Gre za kemijsko interakcijo med antocianini, naravnimi pigmenti v grozdnih jagodah, in brezbarvnimi fenolnimi spojinami, kot so flavonoli ali hidroksicimetne kisline in tudi drugimi spojinami vina. Kopigmentacija izboljša barvo vina tako, da poveča absorpcijo svetlobe (hiperkromni učinek) in premakne barvni odtenek v modro-rdeče tone (batohroni premik). Ta interakcija ohranja intenzivno barvo v zgodnjih fazah staranja vina, ko so monomerni antocianini še v visokih koncentracijah (Moreno and Peinado, 2012; Boulton in sod., 1996). Kopigmentacija tako omogoča pridelovalcem rdečih vin izboljšanje vizualne kakovosti vina, povečuje njegovo stabilnost in podaljšuje trajnost barvne intenzitete, kar je ključno za tržno privlačnost vina.

Reakcije antocianinov z drugimi spojinami se nadaljujejo tudi fermentacijo in maceracijo, ko začnejo reagirati z drugimi produkti fermentacije in grozdja in fenolnimi spojinami in poznavanje tovrstnih spememb lahko pomagajo vinarju izboljšati kakovost vina, oziroma razumeti kakšne spremembe se bodo dogajale v vinih s časom. Te spremembe so še posebej vidne v bolj rahlo obarvanih rdečih vinih ali rose vinih, ko gredo barvne note iz lepe rdeče ali rožnate barve (v primeru rose vin) v opečnate tone.

Tudi med zorenjem in staranjem vina antocianini nadalje reagirajo z drugimi spojinami, ki so prisotne v vinu, kar povzroči nastanek novih pigmentov. Imenujemo jih piranoantocianini. Med njimi so najbolj poznani vitizini in vinilfenolni piranoantocianini. Te spojine so odgovorne za spreminjanje barve vina med staranjem (He in sod., 2012b ; Alcalde-Eon in sod., 2006), saj imajo večjo intenzivnost barve in so stabilnejše v kemijskem okolju vina (če vino razumemo kot raztopino). Manj so dovzetni za spremembe v vrednosti pH, v koncentraci kisika in imajo večjo odpornost na razbarvanje z žveplovim dioksidom in temperaturo (Freitas in sod., 2017). Zato so te spojine tudi interesantne kot potencialna naravna barvila v drugih živilskih izdelkih.

Pri sintezi piranoantocianinov imajo kvasovke s sproščanjem metabolitov, prokurzorjev za nastanek vinifenolnih piranoantocianov, veliko vlogo (Božič in sod., 2020a), kar je prikazano na sliki 2. Kvasovke z visoko aktivnostjo encima hidroksicinamatna dekarboksilaza (HCDC) lahko dekarboksilirajo fenolne spojine hidroksicimetne kisline v reaktivne vinilfenole, ki se kondezirajo z antocianini in tako nastanejo piranoantociani. Hidroksicimetne kisline p-kumarna, kavna, ferulna, sinapinska kislina lahko tudi neposredno reagirajo z antocianini a ta mehanizem poteka počasi med staranjem vina (Suárez-Lepe in Morata, 2012).

Kvasovke lahko prispevajo pomembno tudi k izgubi barve vin. Sestava in poroznost celičnih sten fermentiranih kvasovk lahko povzroči znatno adsorpcijo hlapnih spojin oziroma adsorpcijo antocianinov na celične stene. Slednja lastnost je še posebej pomembna pri sortah grozdja z nižjo vsebnostjo antocianininov kot je Modri pinot (Morata in sod., 2005).

Analizne metode za določanje antocianov in piranoantocianov v vinu

Pri analizi fenolov in antocianinov v vinu se uporabljata dva glavna pristopa. Prvi pristop temelji na določanju skupne vrednosti monomernih antocianov z uporabo različnih spektrofotometričnih metod.

Drug pristop pa temelji na uporabi separacijskih metod z različnimi sistemi za odkrivanje, kvantifikacijo in identifikacijo antocianov in piranoantocianov v vinih in drugih matriksih.

Ključnega pomena pri analizi antocianov, piranoantocianov je ustrezna predpriprava vzorcev na analizo, ki mora imeti čim boljši izplen in čim bolj ponazarjati dejansko stanje v naravi, seveda pa mora biti tudi cenovno ustrezna za namen tovrstnih analiz vina.

Ta vključuje postopek čiščenja vzorcev in pred-koncentracije, zlasti v primeru določanja piranoantocianov, saj so slednji prisotni v bolj majhnih koncentracijah v primerjavi z antocianini in zaradi kompleksnosti matriksa vina, ki lahko prekrije spojine, ki so prisotne v manjših koncentracijah. Najpogostejši metodi priprave vzorcev sta ekstrakcija tekoče-tekoče (LLE) in ekstrakcija na trdnem nosilcu (SPE). Poznamo več različnih pristopov, ki se razlikujejo v uporabi organskih topil in različnih sorbentov. Ekstrakcija na trdni nosilec omogoča večjo avtomatizacijo postopkov, hitrejšo obravnavo večjega števila vzorcev in tudi enake pogoje ekstrakcij. V okviru priprave vzorcev vina se najpogosteje uporablja zgolj predhodna filtracija brez predhodne dodatne obdelave vzorcev (Aleixandre-Tudo in sod., 2017; Blanco-Vega in sod., 2014; Lorrain in sod., 2013; He in sod., 2012a).

Spektrofotometrične metode za določanje antocianov in piranoantocianov v vinu

Spektrofotometrične metode, ki se uporabljajo za določanje skupnih vrednosti monomernih antocianov so naslednje:

pH diferencialna metoda

Metoda izkorišča dejstvo, da monomerni antociani revrezibilno spreminjajo strukturo in tudi barvo v odvisnosti od pH. Tako je razlika absorbance pigmetov pri 520 in 700 nm in pri pH 1 in 4,5 proporcionalna koncentraciji antocianinov. Za preračunavanje v koncentracijo se uporablja molski ekstinkcijski koeficient antocianina (glavnega) v izbrani raztopini.

Metoda z uporabo klorovodikove kisline

Metoda se uporablja za oceno skupne vsebnosti antocianov. Vzorci vina se razredčijo v 1 M raztopini HCl in čez čas se (30 min) se izmeri absorbanco pri valovni dolžini 520 nm. Običajno se uporabijo 20- ali 50-kratne razredčitve. Koncentracija antocianov se izrazijo kot ekvivalenti malvidin-3-O-glikozida (mg/L).

Metoda z uporabo razbarvanja z metabifulfitom (angleško Bisulfite bleaching method)

Metoda izkorišča dve kemijski lastnosti antocianov; odvisnost od pH in učinek razbarvanja. Metoda podaja kvantitativne informacije o skupni koncentraciji rdečih pigmentov. Pri tem upošteva lastnosti metabisulfita, ki ga ima na barvne pigmente. Antocianine razbarva medtem ko se polimerni pigmenti ne razbarvajo, ker so bolj odproni na razpadanje v prisotnosti SO₂. Absorbanca vzorca, ki se ga tretira z raztopino bisulfita se primerja z absorbanco ne-tretiranega vzorca pri 520 nm. Antociani so izraženi kot ekvivalenti malvidin-3-O-glikozida (mg/L). Metoda poda informacije o skupni vsebini monomernih antocianov ob odštetju polimerne frakcije (Aleixandre-Tudo in sod., 2017; Giusti in Wrolstad, 2001). Piranoantociana kot sta vitizin A in vitizin B se ne razbarvata ob prisotnosti bisulfita, in sta izražena kot polimerna barva. Ob uporabi te metode lahko rezultati pokažejo preveliko koncentracijo antocianov, ker na nekatere polimerne pigmenta vpliva tudi učinek razbarvanja, kar je bolj izraženo v mladih vinih. Pri staranju vin nastanejo bolj kompleksni pigmetni, ki so manj občutljivi na SO₂ (Aleixandre-Tudo in sod., 2017).

Separacijske metode za določanje antocianov in piranoantocianov v vinu

Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC) je najpogosteje uporabljena analizna tehnika za ločevanje in separacijo ter identifikacijo polifenolnih spojin grozdja in vina, med njimi tudi antocianov. Pri tem se uporabljajo različni detektorji: masni spektrometer (MS), detektor na niz diod (DAD), UV-Vis detektor. Najpogosteje se pri potrditvi identifikacije uporablja podatke vseh detektorjev, zlasti če standardne spojine niso dostopne na trgu.

Trenutno ne obstaja enotna kromatografska tehnika, ki bi lahko ločila različne skupine fenolnih spojin z eno kromatografsko analizo. Zato moramo, če želimo celoten določiti profil fenolnih spojin, optimizirati izbor stacionarne faze, mobilne faze, gradientno eleucijo, temperaturo in hitrost pretoka mobilne faze. Običajno se ločevanje fenolnih skupin izvaja z uporabo reverzno-fazne kromatografije, kjer se uporablja nepolarna stacionarna faza in polarna mobilna faza (López-Fernández in sod., 2020). Polifenolne spojine grozdja in vina se med seboj razlikujejo v polarnosti, in pri reverzno fazni kromatografiji se iz kolone najprej eluirajo najbolj polarne spojine in nakasneje najmanj polarne spojine. Vrstni red teh spojin je bil že večkrat omenjen in ga lahko najdemo v literaturi in nam lahko tudi pomaga pri idenitifkaciji naših fenolnih spojin grozdja in vina (Kalogiouri in sod., 2022)

Kombinacija, ki se dandanes najpogosteje uporablja za določanje profila antocianov se je reverzno fazna tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (RP-HPLC) z detektorji na niz diod (DAD detektor), masnim spektrometrom (MS) ali tandemsko masno spektrometrijo (MS/MS) (He in sod., 2012a; Lorrain in sod., 2013). Pri uporabi DAD detektorja temelji identifikacija spojin predvsem na merjenju UV-Vis spektra spojine, retencijskega časa in primerjave z retencijskim časom in UV-Vis spektrom analitskega standarda. Glavna pomanjkljivost DAD detektorja je nezmožnost razlikovanja med spojinami, ki imajo podobne spektroskopske značilnosti, čeprav lahko na podlagi spektrov v UV in Vis področju antocianine ločimo od flavonolov, flavan-3-olov in fenolnih kislin. Težavno je tudi razlikovanje med spojinami, ki koeluirajo pod izbranimi kromatografskimi pogoji. Kvantifikacija antocinainov poteka z eksterno kalibracijo z antocianinom samim, v kolikor je standardna spojina tržno dostopna, v nasprotnem primeru pa antocianine lahko izražamo kot ekvivalente glavnega antocianina grozdja in vina, to je malvidin-3-O-glukozid. Na sliki 3 sta prikazana kromatograma vina Pinot Noir na dan stekleničenja (A) in po treh mesecih staranja (B). Prikazana sta UV-VIS spektra malvidin-3-O-glikozida (spojina je označena s številko 1) in piranoantociana malvidin-3-O-glikozid-4-vinilkatehol (spojina označena s številko 2). Za malvidin-3-O-glikozid-4-vinilkatehol so prikazani tudi MS, MS² in MS³ spektri, saj komercialni standardi niso na voljo za identifikacijo. Pri UV-Vis spektru piranoantocianov je viden ožji absropcijski vrh v območju 500 nm, prav tako pa je valovna dolžina, kje je maksimalna absorpcija spektra, premaknjena proti manjšim valovnim dolžinam, saj je absorpcijski vrh pri malvidin-3-O-glikozid-4-vinilkateholu 509 nm, medtem ko je pri malvidin-3-O-glikozidu 526 nm (Božič in sod., 2020b).

Slika 3: Primer kromatograma vina Modri pinot. Na sliki A je prikazan kromatogram pri 520 nm na dan stekleničenja vina. Na sliki B je prikazan kromatogram po treh mesecih staranja na 30 stopinj C (prirejeno po: Božič in sod., 2020b; Topić Božič in sod., 2022).

Uporaba HPLC-DAD metod pri identifikaciji piranoantocianov je zelo omejena, saj komercialni analitski standardi niso na voljo. Za bolj poglobljeno analizo antocianov in piranoantocianov se uporablja HPLC skupaj z masno spektrometrijo (MS) ali tandemsko masno spektrometrijo (MS/MS), ki omogočata identifikacijo in kvantikacijo analitov v vzorcu ali potrditev molekulske strukture. MS temelji na ločevanju analitov glede na njihovo razmerje med maso in nabojem (m/z). Poleg HPLC se za separacijo antocianov in piranoantocianov uporablja tudi tekočinska kromatografija ultravisoke ločljivosti (UPLC). V primerjavi s HPLC so analize krajše, manjša je tudi poraba topil (Dipalmo in sod., 2016; Blanco-Vega in sod., 2014; Lorrain in sod., 2013; Valls in sod., 2009).

Določanje barve vina

Spektrofotometrijska analiza

Barvo vina določamo z merjenjem absorbance svetlobe pri določenih valovnih dolžinah, običajno v območju od 400 do 700 nm. Spektrofotometer pošlje svetlobo skozi vzorec filtriran vina, in absorbanco (koliko svetlobe vino absorbira) merimo pri različnih valovnih dolžinah. V primeru rdečih vin je, v kolikor je absorbanca vzorca prevelika (večja od 1 AU) vzorec potrebno redčiti s pufrom, ki ima pH enak pH vrednosti vina, ali pa uporabimo kiveto s krajšo optično potjo (1 mm namesto 10 mm). Za rdeča se običajno uporabljajo tri ključne valovne dolžine (OIV, 2019):

• 420 nm: za rumenkaste odtenke
• 520 nm: za rdečkaste odtenke
• 620 nm: za modrikaste odtenke.

S seštevkom absorbanc vseh treh valovnih dolžin pridemo do parametra Intenzivnost, z razmerjem med absorbanco 420 nm in 520 nm pa do parametra, ki ga imenujemo odtenek (hue). Metoda je enostavna, hitra in ponovljiva. Primerna je za rutinsko uporabo in omogoča primerjavo med različnimi vzorci vin. Metoda pa ne upošteva upošteva kompleksnosti zaznavanja barve, saj barvo določa samo na podlagi absorbance pri določenih valovnih dolžinah. Prav tako ne zagotavlja podatkov o barvnem tonu in nasičenosti (OIV, 2019).

Moderna metoda CIE Lab

CIE Lab je barvni prostor, ki temelji na človeškem zaznavanju barve. Vzpostavila ga je Mednarodna komisija za osvetlitev (CIE) leta 1976. Barva je opredeljena z tremi koordinatami:

• L*: Svetlost oziroma temnost (0 = črna, 100 = bela),
• a*: Zelena–rdeča os (negativne vrednosti = zelena, pozitivne vrednosti = rdeča),
• b*: Modra–rumena os (negativne vrednosti = modra, pozitivne vrednosti = rumena) (CIE, 2007).

Barva vzorca vina se izmeri s spektrofotometrom ali kolorimetrom, ki podatke pretvori v vrednosti L*, a* in b*. Te vrednosti omogočajo tridimenzionalno predstavitev barve vina, kar omogoča natančno in objektivno primerjavo med različnimi vini (Wrolstad, 2005; Hunter and Harold, 1987).

CIE Lab metoda ponuja popolno sliko barve, vključno s svetlostjo, nasičenostjo in odtenkom. Omogoča natančno kvantifikacijo barvnih razlik, kar je pomembno za kakovostno kontrolo in raziskave. Zahteva bolj sofisticirano opremo in je nekoliko bolj zapletena za izvedbo v primerjavi s klasično spektrofotometrijo. Prav tako je dražja (Wrolstad, 2005; Hunter and Harold, 1987).

Primerjava CIE Lab metode in klasične spektrofotometrije

• Natančnost in kompleksnost: CIE Lab metoda je bistveno bolj natančna in upošteva celotno spektralno zaznavanje barve, medtem ko klasična spektrofotometrija meri le intenziteto svetlobe pri določenih valovnih dolžinah.
• Stroški in zahtevnost: Klasična metoda je cenejša in lažja za izvedbo, medtem ko je CIE Lab bolj zapletena in dražja, vendar ponuja bolj podrobne podatke.
• Uporaba v praksi: Spektrofotometrija je še vedno široko uporabljena v rutinskih analizah zaradi enostavnosti in stroškovne učinkovitosti, medtem ko se CIE Lab uporablja v raziskavah in za visoko kakovostno kontrolo, kjer je potrebna natančna analiza barve (Wrolstad, 2005; Hunter and Harold, 1987).

Praktični del – Določanje profila antocianov

Priprava vzorcev

Določanje profila antocianov v grozdnih kožicah

Grozdne kožice ločimo od pešk in pulpe in jih liofiliziramo do suhega, tako pripravljene zmeljemo v tarilinci do homogenega vzorca. Tako pripravljen 1 g zmletih in liofiliziranih kožic zmešamo z 20 mL metanola (MeOH) HPLC čistoče in postavimo v ultrazvočno kopel za 15 min na stresanje. Uporabimo polietilensko centrifugirko. Sledi centrifugiranje (4 ºC, 5 min, 5000 vrt/min). Postopek ekstrakcije se ponovi štrikat, pri čemer ločeno zbiramo supernatant, sediment pa ponovno izpostavimo ekstrakciji z metanolom v ultrazvočni kopeli.

Supernatant zbiramo, in v tako pripravljenem vzorcu odstranimo metanol z odparevanjem v vakumskemu izparilcu pri 35 stopinjah C do suhega preostanka.. Ekstrakt polifenolov kožic grozdja ponovno raztopimo v natačno odmerjenem volumnu mobilne faze A (kisla mobilna faza) HPLC metode in ga filtiramo z 0,45 µm PTFE filtrom v viale. Vzorec je tako pripravljen za HPLC-DAD analizo.

Protokol ekstrakcije fenolnih spojin iz liofiliziranih kožic grozdja:

• V 50 ml centrifugalno epruveto (polietilensko) zatehtamo 1 g liofiliziranih kožic grozdja.
• Dodamo 20 mL MeOH (HPLC čistoče)
• Ultrazvočna kopel 15 min.
• Centrifuga: 5 min, 5000 vrt/min.(nizka temperature)
• Zbiramo supernatant v čašo.
• Postopek ponovimo še 3x, združimo supernatante in dopolnimo do 100 mL z metanolom.
• Prenesite 4 mL alikvot združenih supernatantov v vialo za shranjevanje in shranimo pri -20 °C.

Analiza vin – direktno injiciranje

Pri tovrstni analizi vina nimamo predpriprave s prečiščenjem in koncentriranjem analitov. Kromatogrami bodo zaradi tega malce grši ampak še vedno dovolj dobri, da iz njih razberemo podatke o vrhovih polifenolov in njihovih retencijskih in spektralnih karakteristikah. Takšno analizo lahko izvedemo le v primeru HPLC-DAD analize, in ob kombinaciji predkolone s kolono. Vzorce vina pred analizo HPLC-MS moramo vedno prečistiti z ekstrakcijo na trdnem nosilcu (SPE). Vzorec filtriramo skozi 0,45 µm PTFE filter in analizirajte s HPLC-DAD.

Slika 4: Kromatogram direktnega injiciranja vina Modri Pinot (povzeto po Topić in sod., 2017).

Analiza vina – SPE ekstrakcija

Zaradi kompleksnosti vinske matrice je včasih potrebno uporabiti SPE ekstrakcijo. Namen SPE ekstrakcije je čiščenje in predkoncentriranje vzorcev, kar je pomembno zlasti pri analizi spojin, ki so prisotne v nizkih koncentracijah (pirananotociani).

Protokol ekstrakcije na trdni fazi (povzeto po Topić in sod. 2017):

• Pripravimo 5 % (v/v) MeOH v ddH₂O.
• Kondicioniranje SPE kartuš (HLB 6 mg, Waters) s 3 ml MeOH in 3 ml ddH₂O (pomembno je da vse raztopine na kolonice SPE dodajamo počasi – uravnavamo pretok tako, da se tekočine na kolonici izmenjujejo s kapljicami). Za izvedbo si lahko pomagamo s pritiskanjem tekočine s pomočjo tlaka (ročno) ali podtlaka z uporabo t. i. manifolda, ki je prikazan na sliki 5.
• Počasi dodajamo 2 mL vzorca vina (filtriranega).
• Speremo nečistoče iz vzorca na SPE kartuši s 5% (v/v) MeOH, eluent zavržemo.
• Osušimo kartušo (uporabimo vakuum, če to izvajamo ročno, enostavno z brizgo večkrat potisnemo zrak skozi SPE kartušo).
• Izperemo/eluiramo fenolne spojine z 1 mL MeOH v vialo.
• Tako pripravljen ekstrakt v MeOH posušimo do suhega (v izparilcu ali pa s pomočjo protitoka dušika) in suh preostanek raztopino ponovno v 1 mL mobilne faze A HPLC analize. Nastavek za sušenje, ki se poveže s tokom dušika, je prikazan na sliki 6.

Slika 5: SPE manifold s primerom SPE kartuš.

Slika 6: Nastavek za sušenje vzorca s protitokom dušika.

Slika 7: Shema protokola za pripravo vzorcev za direktno analizo na HPLC-DAD ali pa s prečiščenjem/koncentracijo na SPE kolonici.

HPLC-DAD analiza

Za analizo HPLC-DAD se uporabljajo največkrat metode, ki uporabljajo ločbo na C18 koloni. Kolone so različne, vse pa ločijo spojine po polarnosti. V tem poglavju upisujemo analizno metodo ki uporablja kromatografsko kolono Kinetex EVO C18 (250×4,6 mm, 5 µm id ) z ujemajočo se zaščitno kolono (Phenomenex , Torrance, ZDA) (Božič in sod., 2020a).

Za izvedbo analize najprej pripravimo mobilno fazo A, in sicer tako, da raztopimo 2.2 % HPLC grade mravlične kisline (v/v) v dvakrat dionizirani vodi (ddH₂O). Mobilna faza B je sestavljena iz 2,2 % mravljinčne kisline, 85 % acetonitrila (ACN, HPLC čistoče), 12,8 % ddH₂ O (v/v). Prenesemo 50 mL mobilne faze A v vialo za shranjevanje z namenom, priprave delovnih raztopin. Osnovna standardna raztopina je zaradi stabilnosti pripravljena v MeOH.

Iz predhodno pripravljene osnovne raztopine malvidin-3-O-glikozida (100 mg/L) v MeOH pripravimo delovne raztopine umeritven krivulje. Vse standardne raztopine antocianinov pripravljamo v MeOH in shranjujemo tesno zaprte v zmrzovalniku. Na tak način ostanejo spojine nespremenjene veliko časa. Če bi jih shranjevali v kislih raztopinah se sčasoma glikozidne vezi razgradijo.

Delovne raztopine za umerjanje koncentracije antocianinov v naših vzorcih pripravimo v območju 1 – 500 mg/L (1 mg/L, 5 mg/L, 10 mg/L, 50 mg /L, 100 mg/L, 250 mg/L, 500 mg/L). Vse raztopine so pripravljene v MeOH, in tako prenešene v viale HPLC, ki so potem izpostavljene uparjanju do suhega čemur sledi rekonstitucija suhega preostanka v mobilni fazi A. Rekonstrukcijo suhih preostankov naredimo v istem volumnu kot vzorce, če je drugačen, si zapomnimo, ker je pomembno pri preračunavanju koncentracij fenolnih spojin.

Ko smo pripravili vzorce standardnih raztopin, potem prenesemo alikvot ekstrakta fenolov grozdnih kožic (500 µL) v vialo HPLC in odparite do suhega, tako kot ste naredili pri standardnih raztopinah (lahko uporabimo avtomatski izparilec ali pa protitok duišika) (dodajsliki Multivac in sistema za vpihovanje dušik v HPLC vialo).

Suh preostanek vzorca ponovno raztopimo v 500 µL mobilne faze A.Tako pripravljen vzorec analiziramo s HPLC-DAD.

Tabela 2: HPLC pogoji kromatografske analize antocianinov in piranoantocianinov.

Iz standardnih raztopin pripravimo umeritveno krivuljo s pomočjo programa za izračun premice. Površine spojin, ki smo jih prepoznali kot antocianine ali piranoantociane preračunamo v koncenteracije v mg/L pri čemer upoštevamo morebitne redčitvene faktorje. Pri analizi vina podajamo rezultate v mg/L vina, medtem ko nas pri kožicah zanima mg/kg ali g suhih kožic. Za vinogradnika in vinarja je sicer najbolj praktičen rezultat na kg grozdnih jagod, če bi želeli preračunati na svežo maso jagod, potem bi morali upoštevati natačno količino mase kožic na kg jagod, in tudi izgubo vode v procesu liofiliziranja. To določimo s tehtanjem vzorcev pred samimi koraki predpriprav biološkega vzorca grozdnih jagod.

Za natančne analize je vse postopke, ki so vir napake potrebno ponavljati vsaj trikrat in določiti napako. Najmanjšo napako ima sama kromatografska analiza in pri podajanju rezultatov je potrebno vedno povedati za kakšne ponovitve gre v samem rezulatu – ali gre za ponovitev iniciranja ali ekstrahiranja, ali pa že biološkega vzorca iz vinograda, ki naj ima najmanj 100 jagod.

Protokol za merjenje barve vin

Barva rdečega vina se lahko določi določena z UV-vis spektrofotometrom. Uporabimo kiveto z dolžino optične poti 1 mm. Vzorec filtriramo skozi 0.45 µm filter in odpipetiramo 500 µL. Izmerimo absorbanco pri treh različnih dolžinah (420, 520 in 620 nm) v skladu z metodologijo OIV (OIV, 2019).

Intenzivnost barve izračunamo kot vsoto absorbanc pri 420, 520 in 620 nm.

Odtenek vina iračunamo kot razmerje med absorbancama pri 420 in 520 nm,

Viri

Alcalde-Eon, C., Escribano-Bailón, M.T., Santos-Buelga, C., Rivas-Gonzalo, J.C., 2006. Changes in the detailed pigment composition of red wine during maturity and ageing. Anal. Chim. Acta 563, 238–254. https://doi.org/10.1016/j.aca.2005.11.028

Aleixandre-Tudo, J.L., Buica, A., Nieuwoudt, H., Aleixandre, J.L., du Toit, W., 2017. Spectrophotometric Analysis of Phenolic Compounds in Grapes and Wines. J. Agric. Food Chem. 65, 4009–4026. https://doi.org/10.1021/acs.jafc.7b01724

Blanco-Vega, D., Gómez-Alonso, S., Hermosín-Gutiérrez, I., 2014. Identification, content and distribution of anthocyanins and low molecular weight anthocyanin-derived pigments in Spanish commercial red wines. Food Chem. 158, 449–458. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2014.02.154

Boulton, R.B., Singleton, V.L., Bisson, L.F., Kunkee, R.E., 2013. Principles and Practices of Winemaking. Springer Science & Business Media.

Božič, J.T., Butinar, L., Albreht, A., Vovk, I., Korte, D., Vodopivec, B.M., 2020a. The impact of Saccharomyces and non-Saccharomyces yeasts on wine colour: A laboratory study of vinylphenolic pyranoanthocyanin formation and anthocyanin cell wall adsorption. LWT 123, 109072. https://doi.org/10.1016/j.lwt.2020.109072

Božič, J.T., Ćurko, N., Ganić, K.K., Butinar, L., Albreht, A., Vovk, I., Korte, D., Vodopivec, B.M., 2020b. Synthesis of pyranoanthocyanins from Pinot Noir grape skin extract using fermentation with high pyranoanthocyanin producing yeasts and model wine storage as potential approaches in the production of stable natural food colorants. Eur. Food Res. Technol. 1–12. https://doi.org/10.1007/s00217-020-03467-2

Champ, C.E., Kundu-Champ, A., 2019. Maximizing Polyphenol Content to Uncork the Relationship Between Wine and Cancer. Front. Nutr. 6.

CIE, 2007. Colorimetry-part 4: CIE 1976 L* a* b* colour space. Int. Stand. 2019–06.

Dipalmo, T., Crupi, P., Pati, S., Clodoveo, M.L., Di Luccia, A., 2016. Studying the evolution of anthocyanin-derived pigments in a typical red wine of Southern Italy to assess its resistance to aging. LWT – Food Sci. Technol. 71, 1–9. https://doi.org/10.1016/j.lwt.2016.03.012

Freitas, V.A.P. de, Fernandes, A., Oliveira, J., Teixeira, N., Mateus, N., 2017. A review of the current knowledge of red wine colour. OENO One 51. https://doi.org/10.20870/oeno-one.2017.51.1.1604

Giusti, M.M., Wrolstad, R.E., 2001. Characterization and Measurement of Anthocyanins by UV-Visible Spectroscopy. Curr. Protoc. Food Anal. Chem. 00, F1.2.1-F1.2.13. https://doi.org/10.1002/0471142913.faf0102s00

He, F., Liang, N.-N., Mu, L., Pan, Q.-H., Wang, J., Reeves, M.J., Duan, C.-Q., 2012a. Anthocyanins and Their Variation in Red Wines I. Monomeric Anthocyanins and Their Color Expression. Molecules 17, 1571–1601. https://doi.org/10.3390/molecules17021571

He, F., Liang, N.-N., Mu, L., Pan, Q.-H., Wang, J., Reeves, M.J., Duan, C.-Q., 2012b. Anthocyanins and Their Variation in Red Wines II. Anthocyanin Derived Pigments and Their Color Evolution. Molecules 17, 1483–1519. https://doi.org/10.3390/molecules17021483

He, F., Mu, L., Yan, G.-L., Liang, N.-N., Pan, Q.-H., Wang, J., Reeves, M.J., Duan, C.-Q., 2010. Biosynthesis of Anthocyanins and Their Regulation in Colored Grapes. Molecules 15, 9057–9091. https://doi.org/10.3390/molecules15129057

Hunter, R.S., Harold, R.W., 1987. The Measurement of Appearance. John Wiley & Sons.

Kalogiouri, N.P., Karadimou, C., Avgidou, M.S., Petsa, E., Papadakis, E.-N., Theocharis, S.,

Mourtzinos, I., Menkissoglu-Spiroudi, U., Koundouras, S., 2022. An Optimized HPLC-DAD Methodology for the Determination of Anthocyanins in Grape Skins of Red Greek Winegrape Cultivars (Vitis vinifera L.). Molecules 27, 7107. https://doi.org/10.3390/molecules27207107

López-Fernández, O., Domínguez, R., Pateiro, M., Munekata, P.E.S., Rocchetti, G., Lorenzo, J.M., 2020. Determination of Polyphenols Using Liquid Chromatography–Tandem Mass Spectrometry Technique (LC–MS/MS): A Review. Antioxidants 9, 479. https://doi.org/10.3390/antiox9060479

Lorrain, B., Ky, I., Pechamat, L., Teissedre, P.-L., 2013. Evolution of Analysis of Polyhenols from Grapes, Wines, and Extracts. Molecules 18, 1076–1100. https://doi.org/10.3390/molecules18011076

Macheix, J.-J., 2017. Fruit Phenolics. CRC Press, Boca Raton. https://doi.org/10.1201/9781351072175

Merecz-Sadowska, A., Sitarek, P., Kowalczyk, T., Zajdel, K., Jęcek, M., Nowak, P., Zajdel, R., 2023. Food Anthocyanins: Malvidin and Its Glycosides as Promising Antioxidant and Anti-Inflammatory Agents with Potential Health Benefits. Nutrients 15, 3016. https://doi.org/10.3390/nu15133016

Minnaar, P., Nyobo, L., Jolly, N., Ntushelo, N., Meiring, S., 2018. Anthocyanins and polyphenols in Cabernet Franc wines produced with Saccharomyces cerevisiae and Torulaspora delbrueckii yeast strains: Spectrophotometric analysis and effect on selected sensory attributes. Food Chem. 268, 287–291. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2018.06.074

Morata, A., Gómez-Cordovés, M.C., Colomo, B., Suárez, J.A., 2005. Cell wall anthocyanin adsorption by different Saccharomyces strains during the fermentation of Vitis vinifera L. cv Graciano grapes. Eur. Food Res. Technol. 220, 341–346. https://doi.org/10.1007/s00217-004-1053-8

Moreno, J., Peinado, R., 2012. Enological Chemistry. Academic Press.

Nikfardjam, M.S.P., Márk, L., Avar, P., Figler, M., Ohmacht, R., 2006. Polyphenols, anthocyanins, and trans-resveratrol in red wines from the Hungarian Villány region. Food Chem. 98, 453–462. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2005.06.014

OIV, 2019. OIV – Compendium of International Methods of Analysis of Wines and Musts (2 vol.), International Organisation of Vine and Wine

Panche, A.N., Diwan, A.D., Chandra, S.R., 2016. Flavonoids: an overview. J. Nutr. Sci. 5, e47. https://doi.org/10.1017/jns.2016.41

Sabra, A., Netticadan, T., Wijekoon, C., 2021. Grape bioactive molecules, and the potential health benefits in reducing the risk of heart diseases. Food Chem. X 12, 100149. https://doi.org/10.1016/j.fochx.2021.100149

Suárez-Lepe, J.A., Morata, A., 2012. New trends in yeast selection for winemaking. Trends Food Sci. Technol. 23, 39–50. https://doi.org/10.1016/j.tifs.2011.08.005

Topić J., Korte D., Mozetič Vodopivec B., 2017. The comparison of anthocyanin and pyranoanthocyanin extraction efficiency in Pinot Noir wine using SPE. V: Book of abstracts

24^th young Investigators Seminar on Analytical Chemistry, Venice, Italy

Topić Božič, J., Butinar, L., Antalick, G., Sternad Lemut, M., Martelanc, M., Albreht, A., Korte, D., Mozetič Vodopivec, B., 2022. The influence of selected indigenous yeasts on Pinot Noir wine colour properties. J. Sci. Food Agric. 102, 664–672. https://doi.org/10.1002/jsfa.11395

Topić Božič, J., Korte, D., Butinar, L., Mozetič Vodopivec, B., 2019. Yeasts and wine colour. Croat. J. Food Sci. Technol. 11, 291–302. https://doi.org/10.17508/CJFST.2019.11.2.17

Valls, J., Millán, S., Martí, M.P., Borràs, E., Arola, L., 2009. Advanced separation methods of food anthocyanins, isoflavones and flavanols. J. Chromatogr. A, Advanced Separation Methods in Food Analysis 1216, 7143–7172. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2009.07.030

Waterhouse, A.L., 2002. Wine Phenolics. Ann. N. Y. Acad. Sci. 957, 21–36. https://doi.org/10.1111/j.1749-6632.2002.tb02903.x

Waterhouse, A.L., Sacks, G.L., Jeffery, D.W., 2016. Understanding Wine Chemistry, Understanding Wine Chemistry. John Wiley & Sons, Ltd. https://doi.org/10.1002/9781118730720

Welch, C.R., Wu, Q., Simon, J.E., 2008. Recent Advances in Anthocyanin Analysis and Characterization. Curr. Anal. Chem. 4, 75–101.

Wrolstad, R.E., 2005. Current Protocols in Food Analytical Chemistry. John Wiley.